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转基因技术及其在农业上的应用

2019-10-29 14:20:35

作者:张仁森,狄然,胡文平,楚星,中国农业科学院北京畜牧兽医研究所

资料来源:基因农业网络

进入21世纪,随着人口的增长和人们需求的变化,农产品的供需矛盾越来越明显。传统的农业生产技术已经难以满足人们的各种需求。转基因技术可以大大提高农业生产效率,因此受到越来越多的关注。迄今为止,转基因技术已经广泛应用于农业、医药、工业和环境保护等领域。世界转基因植物的研发已经从抗虫、抗除草剂等第一代产品转变为改善营养品质、提高产量和耐贮性等第二代产品,以及工业、医药和生物反应器等第三代产品。多基因聚合正成为转基因技术研究和应用的热点。作为农业研究者,我们想谈谈转基因技术及其在农业中的应用。

什么是基因?

有机体由各种细胞组成。细胞的结构从外向内是细胞膜、细胞质和细胞核。细胞核中有一种叫做染色体的物质。不同的生物体有不同数量的染色体,例如,人类有23对染色体,即46条染色体。每条染色体都是由dna双螺旋和许多相互缠绕的组蛋白组成的。那么由这个dna双螺旋中的一个小片段编码的序列就是我们所说的基因(对于原核生物,比如一些病毒,rna序列被用作遗传信息的载体)。基因是遗传信息的基本单位,是染色体或基因组的dna序列。

基因并不神秘,dna也不神秘。事实上,dna分子是根据互补配对原理由两条核苷酸链组成的双螺旋结构的分子化合物。它分为编码链和模板链。编码链包含与生命活动密切相关的遗传信息,即基因。dna的双螺旋就像火车的轨道,但是为了节省空间,生物体尽可能扭曲和折叠“轨道”,所以在电子显微镜下它们看起来像一个不规则的羊毛球。一条染色体只包含一个双螺旋dna,这条“轨道”包含许多基因。不同物种的基因数量差异很大。例如,简单的核糖核酸病毒只有8个基因,流感病毒有大约1700个基因,大肠杆菌有将近4300个基因,水稻有大约46000到55000个基因,人类有大约25000个基因。不同物种之间有一些相似的基因,但也有一些物种特异性基因,所以一些物种特异性优良基因可以转移到目标物种,这就是我们通常所说的转基因。

什么是转基因技术?

转基因技术是将人工分离和修饰的基因引入生物体基因组。通过外源基因的稳定遗传和表达,生物体可以拥有它们所没有的特性,从而更好地满足人们的需求。这里提到的基因不是凭空发明的,而是自然界中某些物种特有的基因。例如,美国在2015年批准了转基因鲑鱼的上市。野生鲑鱼的肉很美味,但是它的生长速度太慢,通常需要4-5年才能上市。然而,另一种鲑鱼的生长速度很快,但是它的肉质却不受人们欢迎。因此,科学家们找到了决定这种鱼快速生长的基因,并将其转移到野生鲑鱼上,从而培育出生长速度快、肉质鲜美的转基因鲑鱼,从而更好地满足人们的需求。另一个例子是普通棉花对棉铃虫的抗性较差,而用苏云金芽孢杆菌bt基因转化的棉花对棉铃虫的抗性显著增加。

转基因技术的分类

人们总是有一个问题,我们能不能吃转基因食品,基因会不会转移到我们身上?事实上,将基因从一个物种的基因组转移到另一个物种的基因组需要特殊的技术,这就是我们所说的转基因技术。仅仅通过吃东西等等是绝对不可能实现转基因的!根据不同的生物物种,转基因技术可以分为三类:植物转基因技术、动物转基因技术和微生物转基因技术。让我们一个接一个地介绍他们。

目前,植物转基因技术主要包括农杆菌介导法、粒子轰击法、聚乙二醇介导法、电穿孔法和花粉管通道法。

农杆菌介导法:农杆菌介导法是先将插入目标基因的植物表达载体转移到农杆菌中,然后通过农杆菌感染植物,即将农杆菌ti质粒或发根农杆菌ri质粒上的目标基因导入植物受体细胞并整合到其基因组中,从而完成目标基因的转化。农杆菌是一种革兰氏阴性细菌,在自然条件下可感染大多数双子叶植物的损伤部位,并可诱导植物产生冠瘿或毛状根。我们每天在地下看到的许多双子叶植物在地面的根和茎的连接处附近有一个帽状肿瘤,这是由土壤杆菌感染引起的。现代分子生物学研究发现土壤杆菌细胞含有一种特殊的质粒,ti质粒或ri质粒。当土壤杆菌感染植物的伤口时,质粒可以将含有多个基因的dna转移到植物细胞中,并将该dna插入植物基因组(我们称之为脱氧核糖核酸t-脱氧核糖核酸)。转移到植物基因组中的这些基因的表达导致植物冠瘿瘤或毛状根的产生。然而,科学家只想将所需基因转移到植物细胞中,而不想让植物产生冠瘿或毛状根。因此,科学家已经对t-dna进行了修饰,以去除致癌基因,并将所需的外源基因插入t-dna。因此,转移到植物细胞基因组中的t-dna含有所需的基因,不会导致植物产生冠瘿或毛状根,从而实现植物细胞的转基因。农杆菌介导法是最早、最深入、应用最广泛的转基因方法,技术相对成熟有效。自1983年首次使用农杆菌介导的方法获得转基因植物以来,科学家们已相继使用这种方法成功获得转基因植物,如番茄、牵牛花和油菜花。

基因枪法:基因枪法最早由美国康奈尔大学生物化学系桑福德提出。这种方法也被称为粒子枪法和高速微爆法。原理是用钨粉或金粉等金属颗粒包裹外源dna,利用高压放电或高压气体作为驱动力,使金属颗粒高速运动进入受体细胞或组织,从而将外源靶基因整合到植物基因组中,培育转基因植物。与农杆菌介导的转化相比,基因枪法不受单子叶或双子叶植物类型的限制,载体质粒的构建相对简单。然而,由基因枪法产生的转基因植物中外源基因的表达是不稳定的,并且成本相对较高,需要特殊的设备。

聚乙二醇介导法:聚乙二醇(peg)法最早由dayey等人于1980年建立。其原理是peg和原生质体(去除所有细胞壁的细胞)在高ph条件下融合,原生质体膜的通透性发生变化,增强原生质体对外源dna的吸收,将目标基因整合到原生质体基因组中,引起特异性表达。该方法对细胞副作用小,转化稳定性和重复性好,可以一次转化多个原生质体,但转化率低。由于peg对原生质体有一定的毒性作用,这种方法不能用于原生质体培养或再生困难的植物。

电刺激穿孔法:迈克尔等人于1985年首次使用电刺激穿孔法进行转基因。细胞质膜在1400v高压下处理以导入外源基因。在培养2-4天的原生质体中检测到外源基因的瞬时表达。电击穿孔法的原理是,当植物细胞受到外部高压电击时,细胞膜会发生不对称穿孔,但这种开放孔的出现是可逆的,电击消除后这些孔会闭合。因此,在此期间,这些孔应被用作将外源基因导入细胞的通道,以便靶基因可以被导入并整合到受体细胞的基因组中。迄今为止,电穿孔技术已成功应用于烟草、番茄、玉米、大豆、小麦和马铃薯等植物的原生质体转化。该方法操作相对简单,但转换效率低。

花粉管通道法:1983年,科学家周光宇通过对中国远缘杂交的研究,提出了dna片段杂交假说,为花粉管通道法提供了理论基础。首次通过花粉管通道法将海岛棉基因导入陆地棉,培育出抗枯萎病棉花新品种。这种方法的主要原理是在植物开花时将含有外源靶基因的dna溶液注入植物花器官的子房,并利用植物开花受精过程中形成的花粉管通道将外源dna导入受精卵细胞,进一步将外源DNA整合到植物细胞基因组中,然后随着受精卵的发育产生新的转基因个体。该方法最大的优点是不依赖植物组织培养,不需要特殊仪器设备,工艺简单,但该方法的重复性仍需进一步提高。

目前,微生物转基因方法主要包括氯化钙法和电转化法。

氯化钙法:这种方法是科恩在1972年首次建立的。原理是细菌在0℃的氯化钙低渗透性溶液中,细菌细胞膨胀成球体,转化混合物中的脱氧核糖核酸形成对脱氧核糖核酸酶(脱氧核糖核酸酶)有抗性的羟基磷酸钙复合物,并粘附在细胞表面。在42℃下短时间热冲击处理后,细胞被促使吸收dna复合物。在合适的培养基上生长数小时后,球形细胞恢复并增殖。在转化的细菌中,重组体中的基因被表达,并且可以在选择性培养基平板上选择所需的转化体。ca2处理后感受态细胞的转化率一般可达5× 106 ~ 2× 107个转化子/μg质粒dna,能够满足一般的基因克隆试验。如果用其它二价金属离子(如mn2、co2)、dmso或基于ca2的还原剂处理细菌,转化率可提高100-1000倍。该化学方法简单、快速、稳定、重复性好,菌株适用范围广。感受态细菌可在-70℃保存,因此被广泛用于细菌外源基因的转化。

电转化:电转化的研究始于20世纪70年代。细胞电融合首次实现于1979年,并于1980年成功应用于质粒导入。电转化的基本原理是,当细胞被置于电场中时,细胞膜充当电容器,电流不能通过离子通道。随着电压的增加,细胞膜成分被极化,并且在细胞膜的两侧产生电势差。当电势差超过某一临界水平时,细胞膜被部分刺穿,形成一些大小足以允许大分子和小分子(如atp)进入或离开细胞的瞬时孔。如果电场强度和脉冲持续时间不超过临界极限,渗透性是可逆的,否则细胞将遭受不可逆的损伤或死亡。

目前常用的动物转基因技术包括核显微注射、精子介导的基因转移、核转移转基因和逆转录病毒。

核显微注射法:在显微镜下,用一根非常细的玻璃针(直径1-2微米)直接将外源dna注射到受精卵细胞中,注射的外源基因与受精卵基因组融合,然后体外培养,最后移植到受体动物的子宫中发育。通过这种方式,有可能产生带有受体动物的转基因动物个体。核显微注射是动物转基因中最常用的方法,但它存在效率低、表达不稳定的缺点,需要大量的动物供体和受体。

精子介导的基因转移方法:这种方法是正确处理动物精子携带外源基因(dna分子并不随机结合到精子上,精子具有自发捕获外源dna的能力。与精子结合后,脱氧核糖核酸内化整合,部分与精子结合的脱氧核糖核酸内化为精子,并能与精子核骨架稳定结合,从而实现精子介导的基因转移)。然后用携带外源基因的精子给发情的雌性动物受精。在雌性动物的后代中,一定比例的动物是转基因个体。与显微注射相比,精子介导的基因转移具有成本低、无需对受体动物进行特殊治疗的优点。

核移植转基因方法:首先,将基因导入体外培养的体细胞,筛选获得带有外源基因的体细胞。然后取出细胞核并转移到卵细胞,从中取出细胞核以产生重构胚胎。然后将重构的胚胎移植到母亲体内,生产转基因动物。体细胞核移植是一种相对较新的动物转基因技术。

逆转录病毒方法:利用逆转录病毒dna的ltr区具有转录启动子活性的特点,将外源基因连接到ltr的下部进行重组,包装成高滴度颗粒,直接感染受精卵,或微注射入胚泡腔,然后将携带外源基因的逆转录病毒dna整合入宿主染色体。该方法操作简单,外源基因整合效率高,动物病毒启动子不仅可以触发一些选择标记基因的表达,还可以触发导入的外源基因的表达。然而,逆转录病毒载体的能力有限,外源基因难以植入生殖系统,成功率低。

从上述转基因方法中,我们可以知道基因从一个物种转移到另一个物种需要特殊的加工和处理来实现基因转移。将基因转移到微生物中相对容易,但将基因转移到植物和动物中相对困难。在将基因转移到植物和动物的过程中,即使这些基因已经经过特殊的加工和处理,我们也必须从数千个实验样品中选择整合了靶基因的转基因个体。因此,仅仅通过食用转基因食品是不可能进行转基因的!有这么多谣言的原因是每个人都不知道通用汽车。

转基因产品

转基因产品是通过转基因技术改造的生物和加工产品,主要包括转基因生物和转基因食品。转基因生物(Genetic modified organisations)是指通过转基因技术改造的生物,通常称为“转基因生物”(gmo),包括转基因植物、动物和微生物,如转基因棉花、大豆、转基因鲑鱼、转基因奶牛等。转基因食品(Genetically modified food)是指通过转基因技术改良的动物、植物和微生物制造或生产的食品、食品原料和食品添加剂,如目前市场上的转基因植物油。

由于转基因技术可以高效、准确地将基因从一个物种转移到另一个物种,打破了物种之间的生殖隔离(理论上,不同物种之间的基因可以通过转基因技术进行交换,植物的基因可以转移到动物身上,动物的基因也可以转移到植物身上,这在过去是不可能的),自从20世纪80年代科学家成功利用转基因大肠杆菌生产胰岛素以来,转基因技术已经广泛应用于农业、工业、医疗等领域。随着人口的增长和生活质量的提高,社会对农业提出了越来越高的要求。我们需要越来越多的高质量食物。杀虫剂的使用将对人体和环境造成巨大危害,各种流行病每年将造成数亿人的损失。随着生活质量的提高,人们不仅满足于吃饱,而且更加注重营养和食物味道的平衡。因此,转基因技术现在也被用来培育具有优良特性的品种,如抗除草剂转基因大豆、抗虫转基因玉米、富含β-胡萝卜素的转基因水稻、抗结核转基因牛等。充分发挥转基因农产品高产优质的优势。到2018年,世界转基因作物种植面积已超过1.9亿公顷,种植的作物主要是大豆、玉米、棉花、油菜等。然而,只有转基因抗虫棉和转基因抗病毒木瓜被批准在中国进行商业化种植。转基因鲑鱼是迄今为止世界上唯一获准上市的转基因动物食品。下面将逐一介绍各种转基因产品。

抗虫转基因植物:棉铃虫、蚜虫等各种害虫每年给农业造成巨大损失。然而,传统的杀虫方法是使用化学杀虫剂。过度使用化学杀虫剂不仅会导致高种植成本,还会影响人类健康。人们需要一种新的抗虫方法。转基因技术的出现使得这种新的抗虫方法成为可能。抗虫转基因植物是指已经转移了抗虫基因的植物。由于抗虫基因的转移,植物本身可以对害虫免疫,从而减少化学杀虫剂的使用。目前常用的抗虫基因主要包括bt毒素蛋白基因、蛋白酶抑制剂基因、植物凝集素基因、淀粉酶抑制剂基因等。抗虫bt基因是工业应用的焦点。Bt毒素是苏云金芽孢杆菌天然产生的各种蛋白质毒素的家族。它无毒,因为bt蛋白受体存在于鳞翅目幼虫的肠道中。当bt蛋白与它结合时,幼虫会死于肠穿孔。然而,人类肠道缺乏bt蛋白受体,所以它完全无毒。

抗病转基因植物:抗病转基因植物是近年来研究和开发的热点。像害虫一样,各种植物病毒、细菌和真菌不仅每年给农业造成巨大损失,而且杀虫剂的过度使用不仅增加了种植成本,还对人体和环境造成危害。转移抗病基因不仅节约了成本,而且减少了对人体和环境的危害。目前常用的抗病基因包括植物病毒外壳蛋白基因、病毒复制酶基因、核糖体失活蛋白基因、干扰素基因、非植物源杀菌肽基因如拟南芥rps2基因和番茄pto基因。除了抗病毒番木瓜的商业化生产之外,迄今为止,抗纹枯病、稻瘟病、葡萄孢子抗性烟草、抗炭疽病、白粉病和角斑病草莓、抗麻风病、柑橘溃疡病和青果病柑橘已相继种植。

抗除草剂转基因植物:种植作物时杂草是一个大问题。杂草作为作物的竞争对手,会争夺作物的生存空间和养分,大大降低作物产量。然而,目前的除草方法是使用化学除草方法,这种方法会伤害1000个敌人和800个自我伤害。虽然化学除草剂的使用可以清除杂草,但也会对环境和土壤造成危害。因此,科学家试图将抗除草剂基因转移到植物中,培育抗除草剂植物。到2017年,200多种抗除草剂作物已经实现工业化,约占转基因作物总数的70%,包括大豆、玉米、棉花、油菜、向日葵、甜菜和抗草甘膦水稻。抗咪唑啉酮的玉米、油菜、甜菜和水稻;大豆和棉花抗磺酰基腺体;棉花和烟草抗溴苯腈。中国已经获得的抗除草剂转基因作物包括抗巴斯塔的水稻、小麦、烟草、油菜和芝麻。抗莠去津大豆;抗溴苯油菜、小麦和抗草小麦等。Bar基因产物可以修饰草甘膦,是目前应用最广泛的抗除草剂基因,已成功用于小麦、水稻、玉米、大麦、油菜等作物的遗传转化。此外,作为选择标记基因,抗草甘膦的aroa基因、抗溴苯腈的bxn基因和抗绿磺隆的csrl基因也已成功用于不同作物的遗传转化。

抗非生物逆境转基因植物:随着人口的增加,一定面积的土地需要养活的人口也在不断增加,世界范围内适合耕种的土地是有限的,大部分土地并不适合耕种,比如高寒地带、高盐碱地带等,如果能够在这些地方进行作物种植,那么将会极大缓解目前的粮食短缺问题。事实上目前的抗非生物逆境转基因植物研发工作主要集中在抗旱、耐盐碱、抗高温、耐低温转基因植物上。山东师范大学生物学院实验室已培育出耐盐转基因番茄、大豆、水稻、速生杨;孟山都公司已经在美国

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